[摘要]目的：分离培养脂肪干细胞(adipose-derived Stem cells，ADSCs)，探讨其培养上清液对成纤维细胞的生物学作用。方法：从人腹部脂肪组织中分离、培养ADSCs，收集其上清液培养人成纤维细胞。MTT法测定成纤维细胞的增殖；AnexillV／PI双染色法测定成纤维细胞的凋亡：体外细胞划痕法测定其迁移能力。结果：培养获得ADSCs，ADSCs培养上清液实验组成纤维细胞的增殖及迁移均明显大于对照组(P<0．05或P<0．01)：同时其凋亡率也低于对照组(P<0．05)。结论：ADSCs培养上清液能促进成纤维细胞的增殖、迁移及抑制凋亡发生。
[关键词]脂肪干细胞：成纤维细胞：增殖；迁移；凋亡
Effect of the conditioned medium of ADSCs on fibroblasts
Abstract：Objective To isolate and culture adipose-derived stem cells (ADSCs)，and study the effect of the conditioned medium 0f ADSCs(ADSC-CM)on fibroblasts．Methods ADSCs was isolated from human adipose tissue and cultured Then the conditioned medium of ADSCs was used to culture fibroblasts．Cells counting by the MTT method was to determined the proliferation，Annexin V／PI was used to investigate the apoptosis rate of fibroblasts；the cell migration was measured by in intro wound-healing assay．Results ADSCs was derived by culture Compared with those in control group，the proliferation and migration in ADSC—CM group were significantly higher than that in control group(P<0 05 or P<0．01)：and the apoptosis rate of fibroblasts in ADSC-CM group was also found to lower than that in control group(P<0．05)．Conclusion ADSC-CM could obviously promote fibroblasts on proliferation；migration and suppress apoptosis
Key words：adipose-derived stem cells；fibroblast；proliferation；migration；apoptosis
近年来，随着组织工程及再生医学的迅猛发展脂肪干 细胞(adipose—derived stem cellS，ADSCs)鉴于其取卡材方 便，来源丰富，低免疫性及多分化潜能等诸多优点，已成为 人们研究的热点。但以往的研究大多集中在ADSCs多分化潜 能在组织工程和再生医学中的应用，很少关注ADSCs分泌 功能在组织损伤修复中的作用。本实验观察研究了ADSCs分泌功能对成纤维细胞的生物学影响，探讨ADSCs分泌功能促创面愈合的机制。
1材料和方法 1．1主要仪器与试品：DMEM培养液、胰酶、I型胶原酶、二甲基亚砜、MTT、小牛血清(美国GIBCO公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，annexin V凋亡检测试品盒(深圳晶美公司)，Mondel 680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)，YJ一875型超净工作台(苏州净化设备厂)，CO2细胞培养箱(美国科学仪器公司)，倒置显微镜(日本0LYMPIJS公司)，流式细胞仪(美国EOICS公司)。
1．2 ADSCs分离与培养：取腹部外科手术患者皮下脂肪组织约59(获病人同意)，无菌条件下用剪刀剔除血管及其它组织碎片，用含双抗的PBS液回归浸泡冲洗3次，每次约5min，用眼科剪将脂肪组织剪成约lmm3的碎块，置于0．1％的I型胶原酶中于37℃水浴振荡消化1h；加入等体积l0％胎牛血清终止消化后，用200目的细胞筛网过滤，600g离心lOmin，弃去上层脂肪及上清液，沉淀用含l0%胎牛血清培养液重悬接种于培养瓶，置于37℃、5％的C02培养箱中常规培养。2天后换液，细胞长满80％时传代培养。
1．3 ADSCs培养上清液的制备：选择生长良好第3代．ADSCs细胞接种于75cm2的培养瓶，生长至80％融合时，换成尢血清培养液DMEM15ml，培养3天后，收集上清液(ADSC-CM)。上清液经O．22μm的滤膜过滤．分装，一80。C冻存备用。
1．4人皮肤成纤维细胞的培养：用组织块法培养原代细胞，置于10％小牛血清培养液中，置于37℃、5％C02培养箱中常规培养。
1．5成纤维细胞增殖的测定：采用MTT法测定。传代时取第3代成纤维细胞以3×10／孔接种于12孔板，常规培养24h后弃上清，设实验组(分别为10％ADSC-CM组、30％ADSC-CM组、50％ADSC-CM组)及对照组，实验组均用ADSC-CM及2％小牛血清配制，对照组仅用2％小牛血清培养液，每组设3个复孔。各组加对应的培养液lml，继续培养3天后，每孔分别加入5g／L的MTT 100μl，37℃、5％C02孵育4h后，终止培养：吸弃上清液，每孔加入750μl。二甲基亚枫，继续孵育lOmin后轻微振荡使紫蓝色沉淀溶解，然后以150μl／孔转移至96孔板，每孔重复5次。用酶标仪测定490nm波长下的吸光度(OD)值。
1．6成纤维细胞凋亡的测定：用Annexin V／PI双标记法分析细胞凋亡率。接种2×10⑸个成纤维细胞于6个25cm2培养瓶，设实验组及对照组，各重复3次。24h后常规换液．细胞达70％～80％融合时，弃上清，以无血清DMEM同步化24h，弃去培养液，分别加入5m终浓度为0．5nunol／L2H2于实验组(用等体积含2%小牛血清培养液加等体积ADSC-CM)与对照组(仅用含2%小牛血清培养液)，12h后用0．125％胰酶消化，离心1 000rpm，5min，用无血清DMEM制备单细胞悬液后行annexin v／PE双染，于流式细胞仪上进行细咆计数分析其凋亡情况。
1．7成纤维细胞迁移的测定一体外细胞划痕法：接种成纤维细胞于6个35cm2小培养皿，实验组及对照组各重复3次，当细胞单层融合时用无血清培养基DMEM培养24h，用无菌200μl枪头在培养皿底部划痕建立体外细胞损伤模型。然后用DMEM冲洗划痕区残留细胞及死细胞。实验组各加入2ml等体积ADSC—CM和2％小牛血清，对照组各加2ml 2％小牛血清，每个划痕区细胞边缘间等距离选4个点，在倒置显微镜下(40×)照像，并利用显微标尺测量各点划痕区划痕宽度，分别选时间点0、12、24、36、48h测量。细胞迁移能力用细胞迁移距离表示，细胞迁移距离=原划痕宽度一现划痕宽度。
1．8统计学处理：所得实验数据以x±s表示，行完全随机设计的单因素方差分析(ANOVA)，多组之间两两比较LSD-t检验，应用SPSS 10．0统计软件进行统计分析。
2结果 2．1 ADSCs的特征：从脂肪中分离出的ADSCs，培养7天后，贴壁的ADSCs呈现出梭形。
2．2 ADSCs培养上清液促成纤维细胞增殖作用：应用MTT法测定不同浓度ADSC-CM作用成纤维细胞3天后，检测其对成纤维细胞增值的影响。结果显示，实验组：10％ADSC—CM组、30％ ADSC-CM组、50％ADSC-CM组的OD值分别为0．469±0．009、O．633±0．034、0．733±0．018，2％小牛血清的对照组(0．443±0．021)比较，其中l0％ADSC-CM组与对照组OD值比较差异无统计学意义(P>0．05)。而30％ADSC-CM组和50％ADSC-CM组OD值却高于对照组(P
2．3 ADSCs培养上清液抗成纤维细胞凋亡作用：收取实验组及对照组细胞染色后行流式细胞仪观察细胞凋亡(附一组流式散点图)。ADSC-CM培养组比对照组成纤维细胞发生早期凋亡、晚期凋亡以及坏死细胞均明显减少。
实验组细胞凋亡率为(11．23±3．356)％，对照组细胞凋亡率为(35．23±7．493)％，两者比较差异有统计学意义(P<0．05)。
2．4 ADSCs培养上清液促成纤维细胞迁移作用：0、24、a8h时间点实验组和对照组成纤维细胞迁移情况。由图可见，实验组各时间点迁移距离明显人于对照组。实验组及对照组细胞迁移距离在时间点36h．t8h均存在显著性差异，差异有统计学意义(P
3讨论创伤修复一直是外科领域既古老而义根本的问题，同时也是烧伤整形外科学的研究重点。它是一个复杂而有序的生物学过程，这些过程联系紧密且相互交义。其中一系列修复细胞(如角质形成细胞、成纤维细胞及内皮细胞)和多种细胞因子的生物学作用成为此过程的关键。
近年来，随着分子生物学在临床应用的发腱，细胞因子在组织修复中的作用已经比较明确，许多细胞因子可以加速 组织的修复，甚至逆转修复不良状态。研究报道，应用 ELISA法检测到ADSCs可分泌大量的细胞因子(如VEGF、 HGf、bFGF、IGF_I、SDF-1a等)，同时RT—PCR法也检测到相 应细胞因子 mRNA的表达。并且已有的研究表明这些细 胞因子具有多种生物学活性：①强促有丝分裂作用，促进细 胞增殖；②强趋化作用，促进细胞迁移：③拮抗细胞凋亡 作用；④免疫抑制和免疫调节作用；⑤参与干细胞诱导 分化作用：⑥参与机体多种器官组织细胞生长、再生与重 建作用。
本实验应用不同浓度的ADSCs条件培养液(ADSC-CM) 作用于成纤维细胞，通过MTT法、体外细胞划痕损伤实验观 察ADSC-CM对成纤维细胞的乍物学作用。结果表明，与对照组(仪用2％小牛血清培养液)比较，ADSC-CM可明显促进成纤维细胞的增殖与迁移作用。其主要机制可能为ADSC-CM含有效较的促细胞增殖、迁移的细胞因子(如VEGF、HGFbFGF等)。这可能与 Shigemura等先前报道的效应机制相一致。众所周知，成纤维细胞的增殖、迁移是创面愈合的两个重要因素。因此，实验结果提示 ADSCs 可能在创面愈合中借助其分泌功能发挥促愈合作用。另一办面，本实验通过建立H202诱导细胞凋亡模型，利用Anexin V／PI双染色法及流式细胞仪测定发现实验组(ADSC-CM)具有明显抵抗损伤细胞凋亡的作用。其细胞保护效应也可能为ADSCs分泌人疑抗凋亡因子的结果。已有学者报道ADSCs分泌的SDF-l可激活P13一K／Alk通路，调节bcl-2蛋白表达，而bcl-2基因及蛋白上调为细胞逃避凋亡的重要机制之一。此外，在预实验中通过浓度筛选发现，在2％小牛血清的血清条件下成纤维细胞可维持基本乍存状态，实验用2％小牛血清来培养对照组细胞，其目的就是较人限度地减少血清对实验的影响。
临床实验也表明应用单一的牛长因子来促进组织损伤修复，难以取得理想效果，其主要原因可能为损伤组织的修复足一个需要多种生长因子共同作用的复杂病理生理过程。
而目前的研究表明ADSCs能分泌多种细胞因子(主要为各种生长因子)，并且实验也初步证实了ADSCs分泌物具有促进成纤维细胞增殖、迁移和抑制凋亡的多种生物学效应。因此，实验提示，与ADSCs多分化潜能一样，ADSCs分泌功能在创面愈合过程中具有重要意义。
总之，我们的研究从探索ADSCs分泌功能入手，观察ADSCs培养上清液对成纤维细胞的生物学作用，初步揭示了ADSCs修复组织损伤的一个重要潜在机制，即ADSCs的分泌功能可能在创面愈合巾发挥重要作用。这为今后仃效运用ADSCs修复创面提供了一定的实验基础。
本文转自:中国美容医学